做SOE PCR 无论如何都连接不上，哪位能帮忙想想办法！~~~

更新时间：2025-01-09 13:01:25

重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。可以有三种方法来设计引物，具体如下图所示。

引物F及R为基因两端特异引物，其中Fm及Rm为中间引物。其中引物Fm及Rm中间共享一段序列（至少10bp完全匹配，否则后续实验很难成功），突变点可以设计在Fm或Rm，也可以两条引物上都有突变点。突变点最好是位于引物的5’端，尽量避免出现在3’端。

2.分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对进行PCR。注意该步一定要用pfu酶，不要用Taq酶，因为Taq酶容易在PCR产物末端加A，从而可能会使产物移码突变。

3.分别回收第2步所得两条PCR产物（一定要用胶回收，准确回收两条目的条带）。

4.将第3步所得两份PCR产物进行混合使其互为模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq酶进行PCR。进行PCR约5-10轮即可。

5.取第4步PCR产物做为模板，加入引物F及R进行PCR扩增出具有突变的全基因。建议可以优化退火温度，可以做个梯度PCR。

如果认为设计引物方面没有问题，那么再考虑其它条件。